核酸检测室气溶胶产生及预防

点击次数：5849 发布时间：2021-01-28

核酸检测实验是微观的，基于细胞，分子，蛋白水平，而这些微观样本对外界环境的影响敏感，比如温度、ph值、酶解、损伤等，在我们尽力呵护样本的生存环境的同时，污染也是需要注意的头等大事，要坚决避免环境中的“杂质”的乱入，包括样本污染，试剂仪器交叉污染、产物气溶胶污染等对实验结果的影响。“易查不易察”，污染来的悄无声息，防不胜防，假阳性结果让无数核酸检测人员抓狂和崩溃。
一旦出现实验室环境污染，比如样本之间交叉污染、试剂污染、仪器污染、阳性对照污染、PCR扩增产物污染、气溶胶污染等，其中气溶胶污染是一个非常重要而被忽视的污染源。实验室出现气溶胶污染，需要较长的时间进行*。

一、气溶胶污染原因
1、样本之间交叉污染。
标本污染主要有收集标本的容器被污染；标本存放运输时，由于密封不严或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；核酸模板在提取过程中，由于加样枪污染导致标本间污染；手动提取核酸样本时，污染的手套触摸离心管内盖导致的污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
2、PCR试剂污染
PCR试剂在配制过程中，移液枪、枪头、离心管等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。
3、不同工作区域移液枪等耗材交叉使用。
将易污染区域的移液枪、枪头、离心管等耗材拿到洁净区使用引起的污染；
4、离心机转子未定期擦拭。
离心机通常进行各种试剂组分、不同盲样的离心，如果离心管外部沾染病毒、阳性核酸或阳性质粒，容易造成污染。
5、阳性对照造成的污染。
开盖时间过长高浓度质粒挥发到室内，阳性对照组分未使用完任意丢弃，加完阳性对照的枪头未放入消毒液中。
6、扩增产物开盖造成的污染。
这是PCR试验中主要、常见的污染原因。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测拷贝的极限，PCR产物开盖后，极易迅速造成扩散，极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
7、各个实验室擦桌布、扫把，簸箕，工作服交叉使用。

二、核酸检测实验室如何预防污染
1、合理的实验分区
原则上可以设置3个独立的工作区域：
试剂耗材储存与准备区、标本处理和标本准备区（核酸纯化）、扩增检测区，各区域空间*相互独立，不能直接相通。其中试剂耗材储存与准备区必须独立设置。
实验室实施空气流向控制，扩增前和扩增后区域应具有独立通风系统，扩增后区域保持负压状态，其它区域保持正压状态，防止扩增产物进入扩增前的区域。

2、实验操作流程：
（1）样品制备区进行样品处理，核酸提取；
（2）配液区配置反应体系：酶混合液和PCR反应液混合，分装至PCR反应管；
（3）样品制备区加样：样品核酸和阴阳性对照加至反应液中；
（4）PCR扩增区上机扩增检测。务必保持单向操作流程，避免各区实验室污染。
3、各个实验区内试验用品专区
配液区是洁净的试验区域，样品制备区的洁净度稍差， PCR扩增区内是易被污染的区域，各区之间试验物品专区，避免因交叉使用造成实验室污染。
4、试验操作要规范
    （1）正确使用移液枪，保证试剂配比和计量正确，同时避免液体吸入移液枪口造成污染。
    （2）实验的过程中应勤换手套，在进出不同区域或进行模板操作后，都应及时更换手套。
    （3）试剂盒各组分在打开之前应先做瞬时离心(约10s)，将管壁及管盖上的液体甩至管底部，从而减少污染手套或加样器的机会。开管动作要轻，以防管内液体溅出或形成气溶胶，造成污染。
    （4）样本量较多时，应将反应液预混，再分装至PCR反应管，后添加核酸模板，以减少单个添加操作繁琐造成的污染。
    （5）每次试验必须设定阴性对照和阳性对照，读取结果时，在保证阴阳性对照均成立的情况下，判读样本结果才有效。
（6）实验结束后，PCR反应管严禁打开，及时放置杀孢子剂消毒液中浸泡。

三、解决核酸实验室污染方法
（1）开窗通风：如在短时间内要消除实验室污染，开窗通风促进实验室内空气流通，使停留在室内的核酸排放到室外。
（2）紫外灯照射：将实验室内好生物安全柜内物品平铺，打开离心机内盖，然后将紫外等打开照射12-24小时，通风12小时以上。
（3）消毒液降解核酸：及时用诺福过氧化氢杀孢子剂擦拭操作台面和仪器，按照1:10稀释浸泡试验器具，同时按照1:3比例稀释涮洗拖布擦拭地面。
（4）高压：试验耗材、工作衣等进行121℃30分钟高压。

（5）使用核酸污染清洗液喷洒室内降解核酸。

（6）阳性污染特别严重，可以采取干雾过氧化氢消毒熏蒸实验室。