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核酸检测室气溶胶产生及预防

点击次数:114 发布时间:2021-01-28

    核酸检测实验是微观的,基于细胞,分子,蛋白水平,而这些微观样本对外界环境的影响敏感,比如温度、ph值、酶解、损伤等,在我们尽力呵护样本的生存环境的同时,污染也是需要注意的头等大事,要坚决避免环境中的“杂质”的乱入,包括样本污染,试剂仪器交叉污染、产物气溶胶污染等对实验结果的影响。“易查不易察”,污染来的悄无声息,防不胜防,假阳性结果让无数核酸检测人员抓狂和崩溃。
   一旦出现实验室环境污染,比如样本之间交叉污染、试剂污染、仪器污染、阳性对照污染、PCR扩增产物污染、气溶胶污染等,其中气溶胶污染是一个非常重要而被忽视的污染源。实验室出现气溶胶污染,需要较长的时间进行根除。
 
一、气溶胶污染原因
1、样本之间交叉污染。
标本污染主要有收集标本的容器被污染;标本存放运输时,由于密封不严或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;核酸模板在提取过程中,由于加样枪污染导致标本间污染;手动提取核酸样本时,污染的手套触摸离心管内盖导致的污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。
2、PCR试剂污染
PCR试剂在配制过程中,移液枪、枪头、离心管等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。
3、不同工作区域移液枪等耗材交叉使用。
 将易污染区域的移液枪、枪头、离心管等耗材拿到洁净区使用引起的污染;
4、离心机转子未定期擦拭。
离心机通常进行各种试剂组分、不同盲样的离心,如果离心管外部沾染病毒、阳性核酸或阳性质粒,容易造成污染。
5、阳性对照造成的污染。
开盖时间过长高浓度质粒挥发到室内,阳性对照组分未使用完任意丢弃,加完阳性对照的枪头未放入消毒液中。
6、扩增产物开盖造成的污染。
这是PCR试验中最主要、常见的污染原因。因为PCR产物拷贝量大,远远高于PCR检测拷贝的极限,PCR产物开盖后,极易迅速造成扩散,极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。
7、各个实验室擦桌布、扫把,簸箕,工作服交叉使用。
 
二、核酸检测实验室如何预防污染
1、合理的实验分区
原则上可以设置3个独立的工作区域:
试剂耗材储存与准备区、标本处理和标本准备区(核酸纯化)、扩增检测区,各区域空间完全相互独立,不能直接相通。其中试剂耗材储存与准备区必须独立设置。
实验室实施空气流向控制,扩增前和扩增后区域应具有独立通风系统,扩增后区域保持负压状态,其它区域保持正压状态,防止扩增产物进入扩增前的区域。
 
2、实验操作流程:
(1)样品制备区进行样品处理,核酸提取;
(2)配液区配置反应体系:酶混合液和PCR反应液混合,分装至PCR反应管;
(3)样品制备区加样:样品核酸和阴阳性对照加至反应液中;
(4)PCR扩增区上机扩增检测。务必保持单向操作流程,避免各区实验室污染。
3、各个实验区内试验用品专区
配液区是最洁净的试验区域,样品制备区的洁净度稍差, PCR扩增区内是最易被污染的区域,各区之间试验物品专区,避免因交叉使用造成实验室污染。
4、试验操作要规范
    (1)正确使用移液枪,保证试剂配比和计量正确,同时避免液体吸入移液枪口造成污染。
    (2)实验的过程中应勤换手套,在进出不同区域或进行模板操作后,都应及时更换手套。
    (3)试剂盒各组分在打开之前应先做瞬时离心(约10s),将管壁及管盖上的液体甩至管底部,从而减少污染手套或加样器的机会。开管动作要轻,以防管内液体溅出或形成气溶胶,造成污染。
    (4)样本量较多时,应将反应液预混,再分装至PCR反应管,最后添加核酸模板,以减少单个添加操作繁琐造成的污染。
    (5)每次试验必须设定阴性对照和阳性对照,读取结果时,在保证阴阳性对照均成立的情况下,判读样本结果才有效。
(6)实验结束后,PCR反应管严禁打开,及时放置杀孢子剂消毒液中浸泡。
 
三、解决核酸实验室污染方法
(1)开窗通风:如在短时间内要消除实验室污染,开窗通风促进实验室内空气流通,使停留在室内的核酸排放到室外。
(2)紫外灯照射:将实验室内好生物安全柜内物品平铺,打开离心机内盖,然后将紫外等打开照射12-24小时,通风12小时以上。
(3)消毒液降解核酸:及时用诺福过氧化氢杀孢子剂擦拭操作台面和仪器,按照1:10稀释浸泡试验器具,同时按照1:3比例稀释涮洗拖布擦拭地面。
(4)高压:试验耗材、工作衣等进行121℃30分钟高压。

(5)使用核酸污染清洗液喷洒室内降解核酸。

(6)阳性污染特别严重,可以采取干雾过氧化氢消毒熏蒸实验室。

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